酶制剂|纤维素酶的应用研究

作者:优养 | 分类:发酵饲料 | 浏览:59 | 评论:0

自从1906年Seiiliere在蜗牛的消化液中发现能够分解天然纤维素的纤维素酶以来,纤维素酶的研究受到动物营养界的普遍关注,尤其是近年来随着生物工程技术的发展,对纤维素酶生产和应用的研究取得了一定成果。


纤维素酶的种类


纤维素酶按其来源可分为真菌源性纤维素酶和细菌源性纤维素酶两种。细菌源性地纤维素酶来源于分解纤维素的细菌,如瘤胃细菌(黄化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等)和热纤梭菌等,产量和活性较低。真菌源性纤维素酶来源非常广泛,所有能分解晶体纤维素的真菌,均能或多或少地分泌纤维素酶。目前,国内外工厂化生产采用的菌种大多数是木霉、曲霉和青霉等。生产高质量纤维素酶的关键是高产菌株的选育,我国自20世纪70年代就开始了这方面研究,目前已利用现代生物工程技术进行诱变培养,选育出了康代木霉NT15-H、NT15—HI、黑曲霉XT15—H、XT15—HI、绿色木霉等高产菌株,并投入工厂化生产。


纤维素酶的组成


纤维素酶是一种多组分的酶系,采用各种层析、电泳等技术可将纤维素酶分成不同的组分。就目前研究结果看,至少包括三类性质不同的酶。


内切β-1,4-葡聚糖酶来自真菌简称EG,来自细菌简称Len。这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区,随机水解β-1,4-糖音键,将长链纤维素分子截短,产生大量带非还原性末端的小分子纤维素如纤维糊精、纤维二糖、纤维三糖等。


外切β-1,4—葡聚糖酶来自真菌简称CBH,来自细菌简称Cex。此类酶可从纤维素酶的非还原末端一个一个地依次切下葡萄糖单位,产物为α一葡萄糖。该酶对纤维寡糖的亲和力强,能迅速水解内切酶作用产生的纤维寡糖,其专一性较强。


β-葡萄糖着酶简称BG。该酶可水解纤维二糖和短链纤维寡糖生成葡萄糖。对纤维二糖和纤维三糖的水解很快,随葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。该酶的专一性差,实际上可作用于所有的葡萄糖β-二聚物。


三类酶的协同降解机制。上述三类纤维素酶在分解纤维素时,任何单独一种都不能裂解晶体纤维素,只有三种酶共同存在并协同作用时才能完成水解过程。一般来说,外切酶作用于不溶性纤维素的表面,使形成晶体结构的纤维素分子链裂开,长链分子末端部分发生游离,从而使纤维素易于水化;内切酶则作用于经外切酶活化的纤维素,分解其β-1,4-糖苷键,产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖;β-葡聚糖苷酶再将纤维二糖、纤维三糖等分解为葡萄糖。应当指出,该协同降解作用的顺序不是绝对的,而且各酶的功能也不是这样简单固定的。


纤维素酶的理化性质


不同来源的纤维素酶理化性质不尽相同。同一菌株产生的同一酶在不同报道中也存在一定的差异。如报道的来源于拟氏木霉的β-葡萄糖苷酶的最适pH值为6.5,在40℃下最稳定,以纤维H糖为底物的Km为33nunol/l,分子量为98KD,据研究者描述的拟氏木霉来源的β-葡萄糖甘醇的分子量为47KD,等电点(PI)为5.47。


多数真菌和少数细菌的纤维素酶都可糖基化。糖基与蛋白质间以共价键结合,或呈可解离的络会状态。糖基化作用在一定程度上可保护纤维素酶免受蛋白酶的水解,同时,纤维素酶由于糖基化使其所含碳水化合物比例在不同酶之间发生差异,导致酶的多形式和分子量的差异。真菌的EG包括两种异构酶EGI和EGlll。EGI的等电点为4.2,分子量为54KD,由437个氨基酸组成。EGHl的等电点为4.8~5.6,分子量为49.SKD,由397个氨基酸组成。木霉的CBH的异构酶为CBHI和CBHI。其中CBHI的等电点为4.2,分子量为66KD,由496个氨基酸组成。CBHI的等电点为59,分子量为53KD,由447个氨基酸组成。BG的等电点为7.5~8.5,分子量为70KD~80KD,由714个氨基酸组成。


纤维素酶的基因克隆和高效表达


迄今为止,人们已经从40多种细菌和数种真菌中克隆到了纤维素酶的基因,其中大多数的核苷酸序列已被测定。


大多数克隆的纤维素酶基因能够在E.coli中表达出可检测的EG和CBH活力。利用重组大肠杆菌高效表达了来源于菊欧文氏菌的内切β-1,4-葡聚糖酶基因celZ。但在大肠杆菌中表达纤维素酶基因存在两个问题,一是不易提取,二是表达水平低。为此,人们将目光转向了真核表达系统。目前,应用较多的是酵母表达系统。酵母作为一般传统的工业微生物不产生毒素,用其表达纤维素酶基因,其产物高度糖基化,经正确加工修饰可直接分泌到培养基中,表达水平高。如酵母表达的李氏木霉CBHll、EGI的产量可达100mgh以上,并具有正常的生物学活性。


纤维素酶的作用机理


补充内源酶的不足,刺激内源酶分泌


不同动物消化道的酶系组成不同。牛羊等反刍动物消化道中虽有一定量的微生物存在,但产生的纤维素酶数量有限,使纤维素的消化吸收受到一定限制。而鸡猪等单胃动物由于体内缺乏内源性纤维素酶不能消化纤维素,导致日粮中占相当比例的营养物质随纤维素作为粪便排出。添加纤维素酶可补充内源酶的不足,提高动物对粗纤维的利用率。同时,还可改善消化道酶系的组成、酶量及活性。


破坏植物细胞壁,促进营养物质的消化吸收


植物的细胞壁由纤维素、半纤维素、木质素和果胶等组成。它们在细胞外形成一层稳定而坚固的外壳,阻止了畜禽对细胞内营养物质的吸收。纤维素酶可在半纤维素酶、果胶酶等的协同作用下,破坏植物的细胞壁,使细胞内容物裸露出来,被淀粉酶和蛋白酶进一步降解,提高营养物质的吸收利用率。


消除抗营养因子,提高饲料营养价值


植物性饲料进入畜禽消化道后,其中的纤维素、半纤维素、果胶等大分子物质可部分溶解产生黏性溶液,使消化道内容物的新度增加,对内源酶形成了一个物理屏障,从而影响营养物质的消化吸收。日粮中添加纤维素酶以后,在半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶等的共同作用下,可将纤维素、半纤维素、果胶、戊糖等大分子物质降解为单糖和寡糖,使消化道内容物的浓度降低,增加内源酶的扩散,增大酶与营养物质的接触面积,提高营养物质的消化利用率。


纤维素酶的应用现状


应用方法


在实际生产中,通常将纤维素酶与半纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶等组成复合酶添加到饲料中。目前,国内外利用纤维素酶的方法有体外酶解法和体内酵解法两种。前者是把纤维素酶和秸秆饲料拌匀,在一定温度、湿度和pH值下堆积或密封发酵一定时间,晾干后直接饲喂动物。该法效果好,但费工费时,成本高。后者是把纤维素酶以添加剂的形式加到精料内,拌匀后饲喂动物,借助于动物消化道的内环境发挥作用。该法简单,应用范围广泛。


饲喂效果


在绵羊日粮中每只每日添加纤维素酶309,使处于牧草期的绵羊日增重提高了5.41%,使处于枯草期的绵羊日增重提高了4.91%,同时使羊毛的产量提高了5.04%。用阉牛试验,在日粮中按每头每日添加纤维素酶409,饲喂60天。结果表明,对照组日增重为764.8g,差异极显著(P<0.01)。


在猪基础日粮中添加0.6%和1.2%的纤维素复合酶,结果生长育肥猪增重比对照组分别提高了16.84%和21.86%。添加纤维素酶后,使中性洗涤纤维的消化率由30.3%提高到34.1%,酸性洗涤纤维从68.8%提高到73.9%。在以玉米—豆粕为基础的日粮中添加纤维素酶对生长猪的生产性能无作用。添加纤维素酶制剂,除能提高大麦—豆粕型日粮中蛋白和能量的消化利用率外,其他日粮如典型的玉米—豆粕日粮,对猪的生长性能无影响。


存在问题


纤维素酶的应用虽取得了一定的成果,但存在诸如菌种产酶量低、活力低、最佳添加量和添加方式不明确、成本高及储存加工影响酶稳定性等问题。今后研究的重点主要放在提高酶产量、活力和稳定性上。此外,可采用生物工程技术(基因克隆、基因表达、纤维素酶蛋白分子的改造和设计)来获取高产纤维素酶。


综上所述,纤维素酶可提高饲料利用率,改善粗饲料的营养价值,降低饲料成本,具有广阔的应用前景。今后应对纤维素酶的检测方法、作用机制,酶系组成、耐热性、作用温度、pH值和抗蛋白酶水解能力等方面进行深入研究。

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